SLC25a26敲除小鼠模型，采用的是基于CRISPR/Cas9技術(shù)的完全性基因敲除（Conventional Knockout,KO）。完全性基因敲除是把敲除目的基因的所有外顯子或幾個總要的外顯子功能區(qū)敲除掉，獲得全身所有的組織和細(xì)胞中都不表達(dá)該基因的小鼠模型。條件性基因敲除（Conditional Knockout,CKO），是可以在特定的組織或細(xì)胞中敲除該基因，而該基因在其他組織或細(xì)胞表達(dá)正常。相較于CKO，KO小鼠采集任意組織器官的cDNA，PCR擴(kuò)增，即可鑒定是否目的基因敲除成功。

CRISPR/Cas9技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于其對基因進(jìn)行定位的精準(zhǔn)編輯，在向?qū)NA（guide RNA， gRNA）和Cas9蛋白的共同作用下，細(xì)胞基因組DNA（被看成外源DNA）將被準(zhǔn)確剪切。但是，被CRISPR/Cas9剪切需要滿足幾個條件。第一，待編輯的區(qū)域附近需要存在相對保守的PAM序列（NGG）。第二，向?qū)NA要與PAM上游的序列堿基互補(bǔ)配對。

SLC25a26，該基因?qū)儆诰€粒體載體家族，是定位于線粒體內(nèi)膜上的核編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。臨床發(fā)現(xiàn)包括由呼吸功能不全和水腫引起的新生兒死亡、兒童急性發(fā)作心肺衰竭和緩慢進(jìn)行性肌無力。研究發(fā)現(xiàn)SLC25A26突變會導(dǎo)致各種線粒體缺陷，包括那些影響RNA穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)修飾、線粒體翻譯以及CoQ10和硫辛酸的生物合成的缺陷。而對于該基因在人類衰老階段是否會在肺結(jié)核、心血管疾病中發(fā)揮功能卻鮮有研究，該研究為Nap1l5的研究提供了新的方向與思路。

模型動物飼養(yǎng)在武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物房SPF級動物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特點(diǎn)

門采用專用凈化密閉門并配備觀察窗。單向走道呈順時針走向設(shè)計。屏障系統(tǒng)內(nèi)共有大鼠飼養(yǎng)室1間，小鼠飼養(yǎng)室3間，隔離觀察室1間，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室1間，潔物存放室1間，清洗消毒室1間。此外，屏障系統(tǒng)外配有監(jiān)控室、機(jī)房和配電室等。

（2）設(shè)計參數(shù)

室內(nèi)溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對濕度：40%～70%；換氣次數(shù)：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強(qiáng)梯度：20～50Pa；空氣潔凈度：7級；菌落數(shù)：≤3個/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；動物照度：15～20lx；晝夜明暗交替時間：12/12h。

（3）通風(fēng)和空調(diào)系統(tǒng)

動物實(shí)驗(yàn)室采用全新風(fēng)中央空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)?？諝饨?jīng)過初、中、三級過濾器后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室內(nèi)環(huán)境。

（4）照明系統(tǒng)

一更、淋浴、二更、氣閘、清潔走道、潔物存放處、污物走道、緩沖間和清洗消毒間、動物飼養(yǎng)室、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備間、隔離觀察室和功能實(shí)驗(yàn)室等安裝有手動和自動開關(guān)，根據(jù)實(shí)際需要，調(diào)節(jié)控制室內(nèi)照明燈。未啟用房間、清潔走道、潔物存放處、污物走道等在每日中午12點(diǎn)和晚上8點(diǎn)開啟紫外線燈照射1h。

（5）通訊系統(tǒng)

因?yàn)镾PF級動物實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境和設(shè)施具有特殊要求，人員進(jìn)入后不能隨意出入，而室內(nèi)外的聯(lián)系又十分重要，故室內(nèi)各房間均安裝內(nèi)部電話機(jī)，按照房間順序編排電話號碼，各室內(nèi)電話可相互連通，并均與監(jiān)控室總機(jī)保持聯(lián)系，保證實(shí)驗(yàn)室內(nèi)外信息的及時溝通。

（6）監(jiān)控系統(tǒng)

對SPF級動物實(shí)驗(yàn)室的出入口、走道、實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)室、功能操作室等重要位置均安裝了可作270°旋轉(zhuǎn)的攝像機(jī)，能夠及時了解設(shè)施的運(yùn)行狀態(tài)；也能有效督促實(shí)驗(yàn)人員執(zhí)行科學(xué)的操作規(guī)程，避免人為因素造成室內(nèi)環(huán)境和設(shè)施的污染；并對整個實(shí)驗(yàn)期間的動物狀態(tài)和反應(yīng)進(jìn)行觀察，減少對動物的滋擾。

（7）供水系統(tǒng)

SPF級實(shí)驗(yàn)動物飲用水以純凈水為宜。本實(shí)驗(yàn)室采用管道供水，將處理后的純凈水用塑膠管道輸送到屏障系統(tǒng)內(nèi)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室，設(shè)置接水槽，為實(shí)驗(yàn)動物供應(yīng)滅菌的飲用水和屏障系統(tǒng)內(nèi)用水。要經(jīng)常更換和清洗輸水管道，清洗籠具的用水添加適當(dāng)比例的84消毒液。

（8）供電系統(tǒng)、警報系統(tǒng)和消防設(shè)施

SPF級動物實(shí)驗(yàn)室要求全天候不間斷供風(fēng)和供電，如果出現(xiàn)故障，不能及時發(fā)現(xiàn)和處理，就可能導(dǎo)致環(huán)境設(shè)施的污染、動物感染或死亡，造成嚴(yán)重后果。因此應(yīng)對SPF級動物實(shí)驗(yàn)室使用獨(dú)立穩(wěn)定的供電系統(tǒng)，并配備有應(yīng)急電源。在中央空調(diào)機(jī)房控制室安裝風(fēng)機(jī)故障警報系統(tǒng)，以便及時檢修和維護(hù)，保證設(shè)施的安全運(yùn)行。

（9）消毒滅菌設(shè)備

為防止外界物品進(jìn)入SPF級動物實(shí)驗(yàn)室時所攜帶的細(xì)菌污染室內(nèi)環(huán)境和造成動物交叉感染，按照不同物品的特性，進(jìn)行紫外線照射消毒、渡槽消毒液消毒或?qū)Ｓ玫臋C(jī)動門真空滅菌器消毒。

（10）動物飼養(yǎng)籠具

飼養(yǎng)大、小鼠的籠具聚碳酸脂材料的塑膠籠具，具有高透明、耐高壓、耐高溫、耐酸堿等特點(diǎn)。通用的不銹鋼籠具長、寬、高分別為40、30、20cm，適用于單籠飼養(yǎng)有特殊要求的實(shí)驗(yàn)動物，配有底盤和食槽，確保實(shí)驗(yàn)動物有充足的采食和活動空間，同時也保證室內(nèi)環(huán)境的清潔。

（11）墊料的選擇和使用

在使用塑膠墊料時，墊料是大小鼠直接接觸的鋪墊物，起到吸濕、保暖和造窩的作用。墊料的好壞直接影響到大小鼠術(shù)后的恢復(fù)、生長發(fā)育和繁殖性能。目前，所使用的墊料主要有玉米秸墊料、刨花墊料。

（12）飼料配制

大小鼠的生產(chǎn)型飼料和維持型飼料必須嚴(yán)格按照國家標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行科學(xué)配制生產(chǎn)。每半年檢測一次飼料的微生物指標(biāo)和有效營養(yǎng)成分指標(biāo)，保證飼料的質(zhì)量。

1、SLC25a26蛋白在TAC手術(shù)模型中表達(dá)上調(diào)

由圖1的WB結(jié)果可以看出，在TAC手術(shù)的模型中，術(shù)后4周SLC25a26的蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)，且兩次實(shí)驗(yàn)具有比較一致的結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)證明SLC25a26在心肌肥厚的過程中可能發(fā)揮重要作用。

圖1 SLC25a26蛋白在TAC手術(shù)模型中表達(dá)上調(diào)。

2、SLC25a26可以抑制心肌肥厚

為了進(jìn)一步探究SLC25a26在心肌肥厚發(fā)生中的具體功能，我們通過siRNA對心肌細(xì)胞中的SLC25a26進(jìn)行了敲低，圖2A敲低水平的檢測，證明siSLC25a26能夠顯著敲低SLC25a26的表達(dá)；敲低SLC25a26后，心臟組織心肌肥厚標(biāo)志物Anp、Bnp及Myh7在心肌細(xì)胞中的mRNA的相對表達(dá)水平明顯上調(diào)表達(dá)（圖2B、2C、2E），而Myh6卻明顯受到了抑制（圖2D），說明SLC25a26在體外確實(shí)可以抑制肥厚。

圖2 敲低SLC25a26可以加重心肌肥厚。（A）SLC25a26的敲低水平驗(yàn)證；（B-E）敲低Nap1l5后，心臟組織心肌肥厚標(biāo)志物Anp、Bnp、Myh6和Myh7在心肌細(xì)胞中的mRNA的相對表達(dá)水平；* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001 vsControl組；P< 0.05，## P < 0.01，### P < 0.001 vs siNeg組。

鑒定結(jié)果示意圖：

1．項目策略概述

利用 CRISPR/Cas9 技術(shù)，設(shè)計并體外轉(zhuǎn)錄 gRNA，將 Cas9、 gRNA 同時注射到小鼠的受精卵中。Cas9 蛋白在 gRNA 引導(dǎo)下結(jié)合到靶位點(diǎn)進(jìn)而造成 DNA 雙鏈斷裂，從而實(shí)現(xiàn)靶位點(diǎn)堿基序列缺失，實(shí)現(xiàn)基因敲除。

2. Western bloting

用RIPA裂解液從冷凍小鼠心臟組織中提取蛋白質(zhì)，形成蛋白溶液。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。通過SDS-PAGE對每個樣品中等量的蛋白質(zhì)（20μg）進(jìn)行分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂奶粉封閉這些膜1小時后，將這些膜與以下相對應(yīng)的一抗在4℃下孵育過夜：SLC25a26（1:1000）、和GAPDH（1:2000）。然后，在室溫下與一抗相應(yīng)的辣根過氧化物酶結(jié)合二抗孵育2h。后使用化學(xué)發(fā)光顯影液在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)上曝光顯示目標(biāo)條帶，并將目標(biāo)條帶用imageJ (National Institutes of Health)進(jìn)行量化分析。以每個樣本中的GAPDH蛋白含量作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，得到每個樣本中目的蛋白的相對表達(dá)水平。

3. 熒光定量PCR

心肌肥厚分子標(biāo)志物檢測。使用TRIzol從將各實(shí)驗(yàn)組小鼠心臟組織中提取總RNA，合成cDNA，然后采用SYBR Green PCR MasterMix進(jìn)行熒光定量PCR。將內(nèi)源性GAPDH的mRNA含量設(shè)為對照檢測心肌肥厚指標(biāo)Anp、Bnp、Myh6、Myh7的mRNA水平。

一、疾病概述 肥厚型心肌病 ( Hypertuophic cardiomyopathy, HCM) 是一種器質(zhì)性心臟疾病，主要表現(xiàn)為左心室和( 或) 右心室及室間隔不對稱肥厚、心室腔變小、心室順應(yīng)性降低。 病因：肥厚型心肌病是常染色體顯性遺傳性疾病，60%～70%為家族性，30%～40%為散發(fā)性，家族性病例和散發(fā)病例、兒童病例和成年病例具有同樣的致病基因突變。 臨床表現(xiàn)：1. 以青壯年多見、常有家族史。 2. 可以無癥狀，也可以有心悸、勞力性呼吸困難、心前區(qū)悶痛、易疲勞、暈厥甚至猝死，晚期出現(xiàn)左心衰的表現(xiàn)。 3. 梗阻性肥厚型心肌患者胸骨左緣可出現(xiàn)粗糙的收縮中晚期噴射性雜音，可伴震顫，應(yīng)用洋地黃制劑、硝酸甘油、靜點(diǎn)異丙腎上腺素及Valsalva動作后雜音增強(qiáng)，反之應(yīng)用β受體阻滯劑、去甲腎上腺素、下蹲時雜音減弱。有些病人聞及S3及S4心音及心尖區(qū)相對性二尖瓣關(guān)閉不全的收縮期雜音。臨床診斷：超聲心動圖提示左心室壁或（和）室間隔厚度≥15mm，排除了其他引起心肌肥厚的原因如高血壓病、風(fēng)濕性心臟病二尖瓣病、先天性心臟病（房間隔、室間隔缺損）及代謝性疾病伴發(fā)心肌肥厚。二、模型背景1、SLC25a26基因信息SLC25a26，該基因?qū)儆诰€粒體載體家族，是定位于線粒體內(nèi)膜上的核編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。該家族成員運(yùn)輸重要的小分子穿過線粒體內(nèi)膜。該蛋白參與s -腺苷蛋氨酸(SAM)進(jìn)入線粒體的運(yùn)輸。該基因的突變與聯(lián)合氧化磷酸化缺陷有關(guān)。? 敲除基因名稱（ NCBI 號）： SLC25a26（67582）? 基因 NCBI 網(wǎng)址鏈接： https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene 67582? 敲除基因名稱： SLC25a26? 方案針對的轉(zhuǎn)錄本（ Ensembl 號）：ENSMUST00000061118.102、實(shí)驗(yàn)動物背景信息所采用的小鼠品系為C57BL/6。來源：1921年立特(Little)用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株，雌鼠57號與雄鼠52號交配而得C57BL1937年從C57BL分離出C57BL/6和C57BL/10兩個亞系。1985年從Olac引到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所。毛色：黑色。主要特性：①乳腺腫瘤自然發(fā)生率低，化學(xué)物質(zhì)難以誘發(fā)乳腺和卵巢腫瘤。②12%有眼睛缺損;雌仔鼠16.8%，雄仔鼠3%為小眼或無眼。用可的松可誘發(fā)腭裂，其發(fā)生率達(dá)20%。③對放射物質(zhì)耐受力中等;補(bǔ)體活性高;較易誘發(fā)免疫耐受性。④對結(jié)核桿菌敏感。對鼠痘病毒有一定抵抗力。⑤干擾素產(chǎn)量較高。⑥嗜酒精性高，腎上腺素類脂質(zhì)濃度低。對百日咳組織胺易感因子敏感。⑦常被認(rèn)作"標(biāo)準(zhǔn)"的近交系，為許多突變基因提供遺傳背景。主要用途：是腫瘤學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)研究中常用的品系。3、研究背景 腺苷蛋氨酸(SAM)是主要的甲基供體，有一個大光譜的目標(biāo)底物。因此，它對幾乎所有的生物甲基化反應(yīng)都是必不可少的。SAM是由胞漿中蛋氨酸和ATP的蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶合成的，隨后分布在不同的細(xì)胞間隔中，包括線粒體，其中甲基化主要用于核酸修飾和呼吸鏈功能。臨床發(fā)現(xiàn)包括由呼吸功能不全和水腫引起的新生兒死亡、兒童急性發(fā)作心肺衰竭和緩慢進(jìn)行性肌無力。研究發(fā)現(xiàn)SLC25A26突變會導(dǎo)致各種線粒體缺陷，包括那些影響RNA穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)修飾、線粒體翻譯以及CoQ10和硫辛酸的生物合成的缺陷。 SLC25A26是s -腺苷蛋氨酸載體(S-adenosylmethionine carrier, SAMC)的編碼基因，是線粒體載體家族的一員，是一組存在于線粒體內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[1, 2]。SAMC的生理作用是催化SAM(通用的甲基供體)從細(xì)胞質(zhì)攝取到線粒體，在那里它是DNA、RNA和蛋白質(zhì)的甲基化所必需的，也是硫辛酸和泛醌生物合成的中間體[3]。SAM是通過蛋氨酸循環(huán)途徑在胞漿中產(chǎn)生的，在蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)運(yùn)酶的催化下，腺苷從ATP轉(zhuǎn)移到蛋氨酸。SAM進(jìn)入線粒體的運(yùn)輸嚴(yán)格依賴于其合成，已知合成受到細(xì)胞質(zhì)代謝和線粒體代謝的調(diào)控[4]。線粒體代謝通過ATP和葉酸的合成來調(diào)節(jié)SAM的產(chǎn)生，葉酸循環(huán)反應(yīng)在細(xì)胞質(zhì)和線粒體中被復(fù)制。此外，甲硫[5]于由同型半胱氨酸產(chǎn)生的胱氨酸b合酶(cystathionine b synthase, CBS)被SAM變構(gòu)激活，半胱氨酸產(chǎn)生的谷胱甘肽與胞質(zhì)SAM的濃度密切相關(guān)，而胞質(zhì)SAM的濃度取決于胞質(zhì)中產(chǎn)生的量并轉(zhuǎn)入線粒體[6]。同樣，SAM對線粒體的可用性可能強(qiáng)烈地改變線粒體甲基化靶點(diǎn)的功能。線粒體DNA (mtDNA)就是這些靶點(diǎn)之一。已知甲基化修飾mtDNA[7]，導(dǎo)致正常和病理條件下mtDNA編碼基因表達(dá)改變[8-10]。 在不同的正?；虿±項l件下，SAM對線粒體的可用性可以改變其線粒體靶點(diǎn)如mtDNA的功能。事實(shí)上，一些研究已經(jīng)強(qiáng)調(diào)了在正常和病理條件下mtDNA甲基化變化如何改變mtDNA編碼基因的表達(dá)[8-11]。此外，其他甲基循環(huán)成分(如葉酸)的可用性也會影響甲基化過程，葉酸水平通過某些腫瘤抑制基因中CpG島的高甲基化與發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險成反比[12]。此外，SLC25A26突變導(dǎo)致SAMC功能受損，顯著影響不同的線粒體過程，如RNA穩(wěn)定性、線粒體翻譯和ATP合成[13]。基于這一證據(jù)，SLC25A26基因的表達(dá)和SAMC的活性有望通過協(xié)調(diào)幾個代謝事件對細(xì)胞功能產(chǎn)生強(qiáng)烈的影響。然而， SLC25A26在肺結(jié)核及心血管疾病中是否發(fā)揮功能，以及作用機(jī)制是什么還有待我們進(jìn)一步的探究。參考文獻(xiàn)：1. Palmieri, F., The mitochondrial transporter family SLC25: Identification, properties and physiopathology. Molecular Aspects Of Medicine, 2013. 34(2-3): p. 465-484.2. Palmieri, F., Mitochondrial transporters of the SLC25 family and associated diseases: a review. Journal Of Inherited Metabolic Disease, 2014. 37(4): p. 565-575.3. Agrimi, G., et al., Identification of the human mitochondrial S-adenosylmethionine transporter: bacterial expression, reconstitution, functional characterization and tissue distribution. Biochemical Journal, 2004. 379: p. 183-190.4. Wallace, D.C. and W.W. Fan, Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics. Mitochondrion, 2010. 10(1): p. 12-31.5. Lacobazzi, V., et al., Hyperhomocysteinemia: Related genetic diseases and congenital defects, abnormal DNA methylation and newborn screening issues. Molecular Genetics And Metabolism, 2014. 113(1-2): p. 27-33.6. Prudova, A., et al., S-adenosylmethionine stabilizes cystathionine beta-synthase and modulates redox capacity. Proceedings Of the National Academy Of Sciences Of the United States Of America, 2006. 103(17): p. 6489-6494.7. Mishra, M. and R.A. Kowluru, Epigenetic Modification of Mitochondrial DNA in the Development of Diabetic Retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2015. 56(9): p. 5133-5142.8. Castegna, A., V. Iacobazzi, and V. Infantino, The mitochondrial side of epigenetics. Physiological Genomics, 2015. 47(8): p. 299-307.9. Iacobazzi, V., et al., Mitochondrial DNA methylation as a next-generation biomarker and diagnostic tool. Molecular Genetics And Metabolism, 2013. 110(1-2): p. 25-34.10. Infantino, V., et al., Impairment of methyl cycle affects mitochondrial methyl availability and glutathione level in Down's syndrome. Mol Genet Metab, 2011. 102(3): p. 378-82.11. Bellizzi, D., et al., The Control Region of Mitochondrial DNA Shows an Unusual CpG and Non-CpG Methylation Pattern. DNA Research, 2013. 20(6): p. 537-547.12. Butterworth, C.E., et al., Folate-Deficiency And Cervical Dysplasia. Jama-Journal Of the American Medical Association, 1992. 267(4): p. 528-533.13. Kishita, Y., et al., Intra-mitochondrial Methylation Deficiency Due to Mutations in SLC25A26. American Journal Of Human Genetics, 2015. 97(5): p. 761-768.