該模型的創(chuàng)新型和應(yīng)用價(jià)值:

建立條件性基因敲除小鼠（血小板特異 NHE1-/-），更加準(zhǔn)確的研究單因素（血小板 NHE1）對于鹽敏感高血壓的作用，提高了結(jié)果的可靠性，可能成為鹽敏感性高血壓防治的新模型。

動物模型制備過程中，由基因工程人員設(shè)計(jì)gRNA靶點(diǎn)及活性檢測，NHE1flox/flox小鼠與條件性敲除小鼠的繁育和鑒定均由具有實(shí)驗(yàn)動物上崗證的專人完成，飼養(yǎng)人員進(jìn)行日常飼喂，由獸醫(yī)進(jìn)行監(jiān)督管理，造模期間動物狀態(tài)良好，病死只數(shù)0，未使用微生物，對環(huán)境沒有影響，造模方法可遺傳。

1、血小板活化結(jié)果分析

2、生理生化結(jié)果分析

3、病理結(jié)果分析

4、血小板生成超微結(jié)構(gòu)分析

1、模型設(shè)計(jì)原理：

GRNA介導(dǎo)Cas9蛋白剪切目標(biāo)外顯子兩端的內(nèi)含子DNA，同時(shí)提供同源模板Donor，基因組兩端通過同源重組修復(fù)方式進(jìn)行DNA修復(fù)，在特定外顯子兩端插入FloxP。 NHE1-FloxP小鼠與組織特異性表達(dá)Cre小鼠交配，從而實(shí)現(xiàn)NHE1基因條件性敲除的目的。實(shí)驗(yàn)采用最新的spCas91.1進(jìn)行注射，減少了基因組中的off-Target。

2、動物模型制備

2.1NHE1floxp/flox小鼠鑒定PCR結(jié)果分析

2.2 NHE1flox/flox, Plt Cre小鼠測序結(jié)果分析

經(jīng)鑒定1#和4#為NHE1flox/flox,Plt Cre 條件性敲除小鼠。

3. 標(biāo)本采集及處理

條件性敲除小鼠2月齡后，稱體重，麻醉后腹主動脈采血至死亡，室溫靜置2h后于4℃ 3000r離心10分鐘提取血清，-80℃冰箱凍存。取心臟、主動脈做石蠟切片，10%中性福爾馬林中固定，30%蔗糖脫水，冰凍切片包埋劑包埋并切片；進(jìn)行免疫組化及免疫熒光檢測，其余血管組織液氮冷凍-80℃保存，提取蛋白進(jìn)行免疫印跡檢測。

一、疾病概述

高血壓是一種由環(huán)境因素、遺傳因素和行為因素相互作用產(chǎn)生的復(fù)雜心血管癥狀，其中高鹽攝入是最重要的環(huán)境因素之一。我國目前高血壓患者已有2億多人，其中鹽敏感性高血壓患者約占總患者的50%。所謂血壓的鹽敏感性是指相對高鹽攝入所引起的血壓升高，且往往伴隨動脈粥樣硬化、腦卒中、慢性腎病等更嚴(yán)重的靶器官損傷。目前約有62%的卒中事件和49%的心血管事件是由高血壓直接引起的。鹽敏感高血壓病理機(jī)制復(fù)雜，動脈血管收縮及腎臟鈉水代謝潴留被認(rèn)為是主要發(fā)病機(jī)制之一。

我國目前抗高血壓藥物也主要通過舒張血管和利尿等方法降低血壓，但遺憾的是藥物治療的患者仍有近半數(shù)沒能有效控制血壓，更缺乏對靶器官損傷及相關(guān)并發(fā)癥的有效控制。

二、模型背景

1、造模因素信息

血小板NHE1基因條件性敲除小鼠模型

2、實(shí)驗(yàn)動物背景信息

C57BL/6小鼠

3、研究背景

近年研究顯示慢性炎癥反應(yīng)在鹽敏感高血壓及心血管疾病發(fā)生中起重要作用。血小板活化引起的炎癥反應(yīng)是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素。活化的 P-selectin 激活血小板并粘附于內(nèi)皮細(xì)胞，形成單核細(xì)胞-血小板連接，促進(jìn)白細(xì)胞化學(xué)趨化和內(nèi)皮組織炎癥浸潤，對心血管疾病的發(fā)展起重要的推動作用[1]。

Na+/H+交換異構(gòu)體1（NHE1）是一種膜結(jié)合蛋白，它通過介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外Na+ /H+離子交換，來維持機(jī)體PH平衡和細(xì)胞容積穩(wěn)定。血小板表面廣泛分布的 NHE1 在血小板活化中起重要作用。血小板 NHE1 通過介導(dǎo)細(xì)胞外Na+內(nèi)流使得細(xì)胞中 Na+濃度升高，并通過NCX向細(xì)胞外泵出Na+交換性的增加血小板內(nèi)的Ca2+濃度而激活血小板[2]。

已有研究發(fā)現(xiàn)高鹽通過誘導(dǎo)血小板活化，參與了鹽敏感高血壓的發(fā)展。研究證實(shí)了鹽敏感性高血壓發(fā)生過程中，NHE1編碼基因在多種組織中異常增高[3-5], 與鹽敏感高血壓的發(fā)展密切相關(guān)，可能是鹽敏感高血壓防治的新靶點(diǎn)。為證實(shí)血小板 NHE1是否是高鹽誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及鹽敏感高血壓的重要靶點(diǎn)，我們制備條件性基因敲除小鼠并進(jìn)行了離體實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，NHE1-/-小鼠血小板NHE1表達(dá)量顯著低于對照小鼠，其血小板細(xì)胞經(jīng)高濃度 NaCl（160mmol/L）溶液培養(yǎng)后，與對照組（正常濃度NaCl，133mmol/L）比較，血小板活化率不增加。

參考文獻(xiàn):

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(NHE1) inhibitor with a suitableprofile for chronic dosing and demonstrated cardioprotective effects in apreclinical model of myocardial infarction in the rat J. Med. Chem. 2012;55: 7114-7140.

3. Farjah M1, Roxas BP, Geenen DL,Danziger RS, Dietary salt regulates renal SGK1 abundance: relevance to saltsensitivity in the Dahl rat. Hypertension. 2003;41(4):874-8.

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