動物癥狀觀察：

表現(xiàn)為體重減輕、弓背豎毛，在回輸后的一個月后死亡。

模型動物飼養(yǎng)在武漢大學人民醫(yī)院動物房SPF級動物實驗室，實驗動物使用許可證SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特點

門采用專用凈化密閉門并配備觀察窗。單向走道呈順時針走向設計。屏障系統(tǒng)內共有大鼠飼養(yǎng)室1間，小鼠飼養(yǎng)室3間，隔離觀察室1間，實驗準備室1間，潔物存放室1間，清洗消毒室1間。此外，屏障系統(tǒng)外配有監(jiān)控室、機房和配電室等。

（2）設計參數(shù)

室內溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對濕度：40%～70%；換氣次數(shù)：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強梯度：20～50Pa；空氣潔凈度：7級；菌落數(shù)：≤3個/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；動物照度：15～20lx；晝夜明暗交替時間：12/12h。

（3）通風和空調系統(tǒng)

動物實驗室采用全新風中央空調通風系統(tǒng)。空氣經過初、中、三級過濾器后進入實驗室內環(huán)境。

（4）照明系統(tǒng)

一更、淋浴、二更、氣閘、清潔走道、潔物存放處、污物走道、緩沖間和清洗消毒間、動物飼養(yǎng)室、實驗準備間、隔離觀察室和功能實驗室等安裝有手動和自動開關，根據(jù)實際需要，調節(jié)控制室內照明燈。未啟用房間、清潔走道、潔物存放處、污物走道等在每日中午12點和晚上8點開啟紫外線燈照射1h。

（5）通訊系統(tǒng)

因為SPF級動物實驗室的環(huán)境和設施具有特殊要求，人員進入后不能隨意出入，而室內外的聯(lián)系又十分重要，故室內各房間均安裝內部電話機，按照房間順序編排電話號碼，各室內電話可相互連通，并均與監(jiān)控室總機保持聯(lián)系，保證實驗室內外信息的及時溝通。

（6）監(jiān)控系統(tǒng)

對SPF級動物實驗室的出入口、走道、實驗動物飼養(yǎng)室、功能操作室等重要位置均安裝了可作270°旋轉的攝像機，能夠及時了解設施的運行狀態(tài)；也能有效督促實驗人員執(zhí)行科學的操作規(guī)程，避免人為因素造成室內環(huán)境和設施的污染；并對整個實驗期間的動物狀態(tài)和反應進行觀察，減少對動物的滋擾。

（7）供水系統(tǒng)

SPF級實驗動物飲用水以純凈水為宜。本實驗室采用管道供水，將處理后的純凈水用塑膠管道輸送到屏障系統(tǒng)內實驗準備室，設置接水槽，為實驗動物供應滅菌的飲用水和屏障系統(tǒng)內用水。要經常更換和清洗輸水管道，清洗籠具的用水添加適當比例的84消毒液。

（8）供電系統(tǒng)、警報系統(tǒng)和消防設施

SPF級動物實驗室要求全天候不間斷供風和供電，如果出現(xiàn)故障，不能及時發(fā)現(xiàn)和處理，就可能導致環(huán)境設施的污染、動物感染或死亡，造成嚴重后果。因此應對SPF級動物實驗室使用獨立穩(wěn)定的供電系統(tǒng)，并配備有應急電源。在中央空調機房控制室安裝風機故障警報系統(tǒng)，以便及時檢修和維護，保證設施的安全運行。

（9）消毒滅菌設備

為防止外界物品進入SPF級動物實驗室時所攜帶的細菌污染室內環(huán)境和造成動物交叉感染，按照不同物品的特性，進行紫外線照射消毒、渡槽消毒液消毒或專用的機動門真空滅菌器消毒。

（10）動物飼養(yǎng)籠具

飼養(yǎng)大、小鼠的籠具聚碳酸脂材料的塑膠籠具，具有高透明、耐高壓、耐高溫、耐酸堿等特點。通用的不銹鋼籠具長、寬、高分別為40、30、20cm，適用于單籠飼養(yǎng)有特殊要求的實驗動物，配有底盤和食槽，確保實驗動物有充足的采食和活動空間，同時也保證室內環(huán)境的清潔。

（11）墊料的選擇和使用

在使用塑膠墊料時，墊料是大小鼠直接接觸的鋪墊物，起到吸濕、保暖和造窩的作用。墊料的好壞直接影響到大小鼠術后的恢復、生長發(fā)育和繁殖性能。目前，所使用的墊料主要有玉米秸墊料、刨花墊料。

（12）飼料配制

大小鼠的生產型飼料和維持型飼料必須嚴格按照國家標準，進行科學配制生產。每半年檢測一次飼料的微生物指標和有效營養(yǎng)成分指標，保證飼料的質量。

1. 小鼠鑒定結果解讀

圖1.鑒定結果圖。27#，30#，19# KO- PCR 反應可以獲得~559bp條帶； WT- PCR 反應可以獲得422bp 條帶，為雜合子。16# KO- PCR 反應未獲得~559bp條帶； WT- PCR 反應可以獲得422bp 條帶，為野生型。注：數(shù)字為鼠尾號，WT為C57BL/6J野生鼠，N為Negative空白對照，M為DNA Marker。2. Cilp2在衰老后表達水平下降 與年輕組相比，男性與女性老年人血漿中Cilp2蛋白水平有顯著降低的趨勢，表明Cilp2在衰老過程可能發(fā)揮了作用（圖2）。

圖2：血漿中年輕人和老年人血漿中的Cilp2蛋白質水平。3. Cilp2過表達會改善衰老性心肌肥厚 通過構建Cilp2重組腺相關病毒，尾靜脈注射至衰老小鼠構建Cilp2過表達組。我們發(fā)現(xiàn)，衰老小鼠的體重與心重與年輕組明顯增加，而Cilp2過表達組與衰老組相比，心臟重量及心臟重量與脛骨長比值顯著降低(圖3A)。此外，通過小動物超聲機檢測各組小鼠的新功能，我們發(fā)現(xiàn)左心室舒張末期直徑(LVSd), 左室后壁厚度(LVPWd)在衰老組顯著增高，表明在衰老后心功能下降；而過表達Cilp2后發(fā)現(xiàn)，LVPWd雖沒有統(tǒng)計學差異，但有下降的趨勢，表明Cilp2可以部分減緩衰老過程中的心功能下降(圖3B)。

圖3.Cilp2對衰老心臟功能的影響。（A）體重、心臟重量和心臟重量/肱骨長的差異比較。（B）超聲檢測三組小鼠的LVSD和LVPWd的差異。4. Cilp2對病理性心肌肥厚的影響 通過qRT-PCR檢測心肌肥厚分子標志物發(fā)現(xiàn)，與年輕心臟的Cilp2 mRNA水平相比，衰老心臟的Cilp2 mRNA水平呈下降趨勢,過表達組Cilp2 mRNA 顯著增高（圖3）。與病理性的心肌肥厚不同，衰老后的心臟Anp、Bnp無顯著升高；而Mhy6 mRNA 水平下降，Mhy7 mRNA水平升高與病理性心肌肥厚一致。Cilp2過表達組有逆轉Mhy6的趨勢（圖3）。

圖3 通過qRT-PCR檢測Cilp2、Anp、Bnp、Myh6和Mh7的mRNA水平。

1. 項目策略圖 此模型采用CRISPR/Cas9技術對Crtc1基因進行基因編輯，原理示意圖如下：

2. 項目策略概述 利用CRISPR/Cas9技術，設計并體外轉錄gRNA, 將Cas9、gRNA同時注射到小鼠的受精卵中。Cas9蛋白在gRNA引導下結合到靶位點進而造成DNA雙鏈斷裂，從而實現(xiàn)靶位點堿基序列缺失，實現(xiàn)基因敲除。3. gRNA序列信息gRNA1: GCTGTTCAGGATGGGCCAAT (5’ – 3’), PAM: GGG.gRNA2: ACAAGCAGAGCAGGTGGGCG (5’ – 3’), PAM: GGG.4. 建立主動脈縮窄建立小鼠心肌肥厚模型（TAC手術），通過超聲心動圖評價心臟功能，小鼠采用異氟脘吸入麻醉，將小鼠左胸前區(qū)剃毛，涂抹耦合劑，取仰臥位對小鼠行超聲檢查。采用高頻超聲診斷儀（VET V6，VINNO，中國），頻率為12.5 MHz，選取標準左心室乳頭肌短軸切面，測量各項指標。5．小鼠心臟組織切片形態(tài)及病理檢測 稱取小鼠體重，小鼠經心臟灌注，取出心臟后用濾紙吸干血液后稱重，計算心臟重量與體重的比值（Heart weight/body weight，HW/BW）。6．心肌肥厚分子標志物檢測將各實驗組小鼠心室肌組織分別提取總RNA，應用qPCR檢測心肌肥厚指標Anp、Bnp、Myh6、Myh7的mRNA水平。

一、疾病概述 健康、衰老和壽命是人們最關心的問題，自古以來人們也一直在探索其中的奧秘。隨著我國進入老齡化社會，年齡增長帶來的疾病嚴重威脅人類的健康，但是目前對于衰老的認識還處于初步階段。衰老引起的左心室纖維化、僵硬和室壁增厚，均會引起心肌舒張功能障礙，導致心力衰竭。在衰老的心臟中，心肌細胞的數(shù)量可能會隨著年齡的增長而減少，但心臟成纖維細胞會明顯增殖，它可以產生細胞外基質和膠原蛋白。心肌成纖維細胞增殖過多時，會出現(xiàn)膠原的合成與降解失衡，膠原比例失衡、細胞排列紊亂，細胞外基質沉積，這是諸多心血管疾病發(fā)展到一定階段共同的病理變化。 目前，心臟衰老及其導致的心肌肥厚的發(fā)病機理尚未完全闡明，臨床上缺乏有效的藥物治療手段。因此，探索心臟衰老和衰老性心肌肥厚病理發(fā)生的分子機制有助于尋找新的藥物作用靶點，改進抗心臟衰老和衰老性心肌肥厚的治療方案，并推動精準醫(yī)療在心臟衰老防治領域的發(fā)展。二、模型背景1、Cilp2基因信息? 敲除基因名稱（NCBI號）：68709? 敲除基因NCBI網址鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/68709? 敲除基因名稱（MGI號）：Cilp2（MGI: 1915959）? 敲除基因Ensembl網址鏈接：? http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary?db=core;g=ENSMUSG00000044006;r=8:69880369-69887687;t=ENSMUST00000057831? 方案針對的轉錄本（Ensembl號）：ENSMUST00000057831.7? 方案敲除的exon：exon 4~62、實驗動物背景信息 所采用的小鼠品系為C57BL/6。 來源：1921年立特(Little)用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株，雌鼠57號與雄鼠52號交配而得C57BL1937年從C57BL分離出C57BL/6和C57BL/10兩個亞系。1985年從Olac引到中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所。 毛色：黑色。 主要特性：①乳腺腫瘤自然發(fā)生率低，化學物質難以誘發(fā)乳腺和卵巢腫瘤。②12%有眼睛缺損;雌仔鼠16.8%，雄仔鼠3%為小眼或無眼。用可的松可誘發(fā)腭裂，其發(fā)生率達20%。③對放射物質耐受力中等;補體活性高;較易誘發(fā)免疫耐受性。④對結核桿菌敏感。對鼠痘病毒有一定抵抗力。⑤干擾素產量較高。⑥嗜酒精性高，腎上腺素類脂質濃度低。對百日咳組織胺易感因子敏感。⑦常被認作"標準"的近交系，為許多突變基因提供遺傳背景。 主要用途：是腫瘤學、生理學、免疫學、遺傳學研究中常用的品系。3、研究背景 衰老，系指隨著時間的增加，生命體功能衰退的過程[1]。壽命長用做低等模式生物評價衰老最重要的指標；而在高等動物中，細胞、組織與器官結構與功能復雜，單純用壽命作為衰老的唯一指標并無全面，有研究認為，改善衰老相關疾病被認為是減輕衰老的表現(xiàn)[2, 3]。衰老相關的系統(tǒng)性疾病包括：心腦血管疾病、腫瘤、骨關節(jié)炎、糖尿病與神經退行性疾?。幌嚓P研究也通常會記錄衰老相關疾病的狀態(tài)來評價個體衰老的情況[4]。宏觀的生命體系統(tǒng)特征往微觀的細胞與分子活動的表現(xiàn)形式，若透過衰老的生物學特征尋找到衰老的細胞、分子調控機制對于延緩衰老至關重要。經典的細胞衰老是指一種不可逆的細胞周期阻滯機制，相關因素包括：端?？s短，DNA損傷，活性氧累積，原癌基因與抑癌基因異?；顒?，代謝改變，未折疊蛋白反應，炎性因子長期刺激，有絲分裂異常造成的應激壓力等[5]。 目前，衰老研究領域也大致分為應激適應、表觀遺傳、炎癥、生物大分子損傷、新陳代謝、蛋白穩(wěn)態(tài)、干細胞與再生七大類[6]。此外，被深入研究過的分子包括p53、p21、p14ARF、p19ARF和p16INK4A因其在衰老過程中發(fā)揮了重要作用，已被普遍用作鑒定衰老的標志物[7]。 軟骨中間層蛋白（cartilage intermediate layer protein，Cilp）主要分布在軟骨細胞中，多個組織中均能表達，其中心臟、中樞系統(tǒng)、骨骼肌表達水平較高。目前，關于CILP的研究較少，其中主要涉及骨關節(jié)炎、腰椎間盤突觸，研究發(fā)現(xiàn)Cilp1與Cilp2與衰老相關疾病骨關節(jié)炎相關，Cilp1對骨關節(jié)炎有損害而CiLp2對其卻有保護作用[8, 9]。此外，另有研究報道[10-12]Cilp1在缺血-再灌注損傷模型中，Cilp1在脈及左心室中的mRNA和蛋白質的表達水平顯著升高，Cilp1可通過抑制TGF-β1/SMAD信號通路來抑制成纖維細胞的活化。與Cilp1類似，Cilp2一部分研究主要集中在Cilp2及其單核苷酸基因多態(tài)性位點與在骨關節(jié)炎的關系；有研究[13]確定了Cilp-2和Pepck存在直接相互作用，并認為Cilp-2在調節(jié)肝臟葡萄糖產生中起著重要作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，Cilp2基因的小t等位基因多態(tài)性對血脂和脂蛋白水平的升高有保護作用[14]。 本研究通過前期質譜結果發(fā)現(xiàn)，Cilp2在老年人血漿中的蛋白水平顯著降低；此外，通過對衰老小鼠注射Cilp2病毒，發(fā)現(xiàn)Cilp2能改善小鼠的心功能。而目前尚未報道Cilp2在衰老心臟過程中的作用，因此本項目擬探究Cilp2對心臟衰老的影響及探究其潛在的分子機制。參考文獻：1. Lopez-Otin, C., et al., The hallmarks of aging. Cell, 2013. 153(6): p. 1194-217.2. Kaeberlein, M., M. McVey, and L. Guarente, The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms. Genes Dev, 1999. 13(19): p. 2570-80.3. Rogina, B. and S.L. Helfand, Sir2 mediates longevity in the fly through a pathway related to calorie restriction. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101(45): p. 15998-6003.4. Childs, B.G., et al., Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing. Nat Rev Drug Discov, 2017. 16(10): p. 718-735.5. van Deursen, J.M., The role of senescent cells in ageing. Nature, 2014. 509(7501): p. 439-46.6. Kennedy, B.K., et al., Geroscience: linking aging to chronic disease. Cell, 2014. 159(4): p. 709-13.7. Sharpless, N.E. and C.J. Sherr, Forging a signature of in vivo senescence. Nat Rev Cancer, 2015. 15(7): p. 397-408.8. Bernardo, B.C., et al., Cartilage intermediate layer protein 2 (CILP-2) is expressed in articular and meniscal cartilage and down-regulated in experimental osteoarthritis. J Biol Chem, 2011. 286(43): p. 37758-67.9. Yao, Z., et al., Characterisation of cartilage intermediate layer protein (CILP)-induced arthropathy in mice. Ann Rheum Dis, 2004. 63(3): p. 252-8.10. Zhang, C.L., et al., Cartilage intermediate layer protein-1 alleviates pressure overload-induced cardiac fibrosis via interfering TGF-beta1 signaling. J Mol Cell Cardiol, 2018. 116: p. 135-144.11. Barallobre-Barreiro, J., et al., Proteomics analysis of cardiac extracellular matrix remodeling in a porcine model of ischemia/reperfusion injury. Circulation, 2012. 125(6): p. 789-802.12. Zhang, C., et al., Genetic determinants of childhood and adult height associated with osteosarcoma risk. Cancer, 2018. 124(18): p. 3742-3752.13. Wu, T., et al., CILP-2 is a novel secreted protein and associated with insulin resistance. J Mol Cell Biol, 2019. 11(12): p. 1083-1094.14. Luptakova, L., et al., Association of CILP2 and ACE gene polymorphisms with cardiovascular risk factors in Slovak midlife women. Biomed Res Int, 2013. 2013: p. 634207.