該小動物模型飼養(yǎng)在清潔級動物中，微生物處于監(jiān)控狀態(tài)，動物房有相應(yīng)的保護措施，小鼠不會出現(xiàn)逃逸，不會對外界環(huán)境造成影響。

圖1 皮下接種H460-RFP腫瘤生長影像分析

圖2 熒光標(biāo)記腫瘤生長曲線

應(yīng)用小動物活體熒光成像系統(tǒng)可監(jiān)測到紅色熒光蛋白在裸小鼠皮下的穩(wěn)定表達，從第1周至第5周，隨著腫瘤移植時間的增加，表達紅色熒光蛋白的面積逐漸增大，熒光光子數(shù)也逐漸增加，移植瘤體積與熒光光子數(shù)成正相關(guān)（圖1、圖2）。

模型制作采用BALB／CA-nu裸小鼠，鼠齡5周，體重15—18 g，在無特定病原體(specific—pathogen free，SPF)的飼養(yǎng)間飼養(yǎng)。

1. 細胞培養(yǎng)：H460細胞為本實驗室凍存

2. 構(gòu)建帶有篩選標(biāo)記的載體：chicken-β-actin- promoter-DsRed

圖1紅色熒光表達載體的構(gòu)建

3. 細胞轉(zhuǎn)染和篩選：采用Lipofectamine 2000 Reagent轉(zhuǎn)染H460細胞。轉(zhuǎn)染后，用含G418的培養(yǎng)液篩選細胞，獲得穩(wěn)定表達RFP的細胞株，選擇其中高表達的克隆株擴大培養(yǎng)（圖2）。

圖2紅色熒光標(biāo)記的H460細胞系（200×）

穩(wěn)定高表達RFP的細胞，在熒光顯微鏡下均呈強熒光，并且熒光較均勻的分布于整個細胞內(nèi)。單克隆RFP細胞在無G418篩選壓力下，傳代數(shù)次后仍能穩(wěn)定高水平表達RFP(圖2)。細胞形態(tài)和未轉(zhuǎn)染細胞無明顯區(qū)別。

4. 腫瘤細胞的植入及活體熒光成像：收集處于生長對數(shù)期的高表達細胞株，進行裸鼠皮下接種，采用活體熒光影像系統(tǒng)攝像動態(tài)觀察。

一、 大細胞肺癌

大細胞肺癌起源于支氣管粘膜上皮，局限于基底膜內(nèi)者稱為原位癌。癌腫可向支氣管腔內(nèi)或和臨近的肺組織生長，并可通過淋巴、血行或經(jīng)支氣管轉(zhuǎn)移擴散。其生長速度和轉(zhuǎn)移擴散的情況與具體的組織學(xué)類型、分化程度等生物學(xué)特性有一定關(guān)系。大細胞肺癌常發(fā)生于肺上葉，多為周圍型，體積較大，邊界清楚，分葉，少見空洞。根據(jù)其病理類型可分為4類：（1）大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌 這是一類顯示神經(jīng)內(nèi)分泌分化的大細胞癌。細胞較大，呈多角形，胞質(zhì)嗜酸，核多形，核仁較明顯，核分裂像多見，常見大面積壞死。免疫組化染色，神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)記陽性，電鏡下可見神經(jīng)內(nèi)分泌顆粒；（2）基底細胞樣癌 細胞較大，立方形或梭形，分葉狀或?qū)嵭猿矤钆帕校苓叢堪┘毎蕱艡跔钆帕校唬?）淋巴上皮瘤樣癌 罕見。組織形態(tài)與鼻咽部淋巴上皮瘤樣癌相同。癌細胞打，泡狀核，核仁明顯，細胞成片或呈巢狀，癌巢內(nèi)及間質(zhì)中有淋巴細胞侵潤；（4）透明細胞癌罕見。瘤細胞打，多角形，胞質(zhì)透明或泡沫狀，無粘液，伴或不伴糖原。伴橫紋肌樣表型的大細胞癌罕見。細胞核大，多形性，胞質(zhì)豐富，有嗜酸性小球，免疫組織化學(xué)既表達上皮性抗原，也顯示橫紋肌表型。

二、 臨床表現(xiàn)及致病機理

肺大細胞癌的臨床癥狀及表現(xiàn)與其他類型肺癌相似，均表現(xiàn)為咳嗽、咯血、胸痛等癥狀，晚期肺癌壓迫鄰近器官、組織或發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移時，可以產(chǎn)生：①壓迫或侵犯膈神經(jīng)，引起同側(cè)膈肌麻痹。②壓迫或侵犯喉返神經(jīng)，引起聲帶麻痹聲音嘶啞。③壓迫上腔靜脈引起面部、頸部、上肢和上胸部靜脈怒張、皮下組織水腫、上肢靜脈壓升高。④侵犯胸膜，可以引起胸腔積液，多為血性。⑤癌腫侵入縱隔，壓迫食管，可引起吞咽困難。⑥上葉頂部肺癌，亦稱Pancoast腫瘤或肺上溝瘤，可以侵入和壓迫位于胸廓上口的器官或組織，如第一肋骨、鎖骨上動脈和靜脈、臂叢神經(jīng)、頸交感神經(jīng)等，產(chǎn)生胸痛、頸靜脈或上肢靜脈怒張、水腫、臂痛和上肢運動障礙，同側(cè)上眼瞼下垂，瞳孔縮小，眼球內(nèi)陷，面部無汗等頸交感神經(jīng)綜合征。少數(shù)癌腫產(chǎn)生內(nèi)分泌物質(zhì)，臨床上呈現(xiàn)非轉(zhuǎn)移性的全身癥狀：如骨關(guān)節(jié)綜合征（杵狀指、關(guān)節(jié)痛、骨膜增生等）、Cushing綜合征、重癥肌無力、男性乳腺增大、多發(fā)性肌肉神經(jīng)痛等肺外癥狀。這些癥狀在切除肺癌后可能消失。但大細胞還有另外的臨床特點：（1）病程短、易侵犯相鄰肺葉：肺大細胞癌較之鱗癌和腺癌分化差、增殖快、病程短，且肺大細胞癌呈侵襲性生長，發(fā)展迅速，是高度惡性神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，早期即可出現(xiàn)淋巴和血行轉(zhuǎn)移，易侵及相鄰肺葉；（2）肺大細胞癌好發(fā)于男性重度吸煙者：吸煙與肺癌的關(guān)系眾所周知，在我國男性吸煙者比率也是大于女性吸煙者，因此在臨床上肺大細胞癌大多為男性，且均有長期吸煙史；（3）以周圍型病變多見：在放射學(xué)檢查時，肺部腫瘤周圍型病變多見，約占80%以上，腫塊未密度均勻的團塊狀陰影，無空洞形成，腫瘤周圍欠規(guī)則，且腫塊巨大，直徑在8cm以上，常伴縱膈淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

大細胞肺癌和其他病理類型的肺癌一樣，確切的發(fā)病原因至今尚欠了解。經(jīng)過多年的大量調(diào)查研究，目前認為與下列因素有密切關(guān)系：（1）吸煙 幾乎所有肺癌患者的發(fā)病與吸煙有關(guān)。吸煙者肺癌死亡率比不吸煙者高10-13倍。吸煙量越多，吸煙年限越長，開始吸煙年齡越早，肺癌死亡率越高。戒煙持續(xù)15年才與不吸煙者相近。吸紙煙者比吸雪茄，煙斗者患病率高。紙煙中含有各種致癌物質(zhì)，如苯并芘，為致癌的主要物質(zhì)。被動吸煙也容易引起肺癌。女性中丈夫吸煙者肺癌危險性增加50%。上海市區(qū)的一項調(diào)查表明，本人不吸煙而與吸煙的丈夫生活在一起的婦女，肺癌危險性平均升高19%，長期與重度吸煙的丈夫生活者，危險性可升高30%。（2）職業(yè)致癌因子 已被確認的致人類肺癌的職業(yè)因素包括石棉，無機砷化合物、二氯甲醚、鉻及其他化合物，鎳冶煉，氡及氡子體，芥子體，氯乙烯，煤煙、焦油和石油中的多環(huán)芳烴，煙草的加熱產(chǎn)物等。在石棉廠工作的吸煙工人肺癌死亡率為一般吸煙者的8倍，是不吸煙也不接觸石棉者的92倍。可見石棉有致癌的作用，還說明吸煙與石棉有致癌的協(xié)同作用。（3）空氣污染 包括室內(nèi)小環(huán)境和室外大環(huán)境污染。如室內(nèi)被動吸煙、燃料燃燒和烹調(diào)過程中可能產(chǎn)生的致癌物。有資料表明，室內(nèi)用煤，接觸煤煙或其不完全燃燒物為致癌的危險因素，特別是對女性腺癌。烹調(diào)時加熱所釋放出的油煙霧也是致癌因素，不可忽視。有報道，烹調(diào)時處于煙霧彌漫的室內(nèi)的女性患肺癌的危險度比處于無或少煙霧室內(nèi)的女性越高60%，且接觸烹飪油煙的次數(shù)越多、年限越長，患肺癌的危險性越大。城市中汽車廢氣、工業(yè)廢氣，公路瀝青都有致癌物質(zhì)存在。其中主要是苯并芘。（4）電離輻射 大劑量電離輻射可引起肺癌。輻射的不同射線產(chǎn)生的效應(yīng)也不同。一般人群中電離輻射來源約49.6%來自自然界，44.6%為醫(yī)療照射，來自X線診斷的電離輻射可占36.7%。（5）飲食與營養(yǎng)大量研究顯示維生素A、B、C、E及β胡蘿卜素能夠抑制化學(xué)致癌物誘發(fā)的腫瘤。一些調(diào)查報告認為攝取食物中維生素A含量少或血清維生素A含量低時，患肺癌危險性增高。（6）肺部既往疾病史 大量流行病學(xué)調(diào)查表明，在對吸煙等混雜因素進行調(diào)整后，肺部疾病史（如肺結(jié)核、慢性支氣管炎等）尤其是結(jié)核瘢痕者，男性患肺癌的危險是正常人群的5倍，女性患肺癌的危險是常人群的10倍。（7）遺傳因素 一個人患肺癌不僅與環(huán)境因素有關(guān)，而且遺傳因素也起著重要作用。中青年人罹患肺癌的主要危險因素是遺傳和吸煙。日本學(xué)者進一步就不同組織類型的發(fā)病情況進行遺傳流行病學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)35..8%的肺鱗癌患者有肺癌家族史，與其他人群相比有顯著差別；58.3%的肺泡細胞癌的女性患者有肺癌家族史，并且她們中3/4的人雙親患有肺癌。遺傳因素是女性肺癌的重要危險因素，不僅支持了肺癌的家族史增加個體患肺癌的危險性，而且也說明了女性對肺癌的遺傳易感性比較高。（8）社會心理因素 有關(guān)肺癌患者與發(fā)病前心理社會因素關(guān)系的兵力對照研究提示，精神長期壓抑者OR值為4.14，按人口暴露率8.8%計算，其人群歸因危險度為21.6%。北京市腫瘤防治研究所對北京市近郊區(qū)350例肺癌進行1:1配對病例對照研究，發(fā)現(xiàn)北京市肺癌效應(yīng)較強的多種危險因素，即呼吸系統(tǒng)疾病，吸煙史、污染源、家族腫瘤史、家庭不和及精神創(chuàng)傷等式導(dǎo)致肺癌的主要原因。不良生活事件引起癌癥的機制尚未闡明，一般認為不良生活事件使機體產(chǎn)生應(yīng)激，出現(xiàn)抑郁、憂慮、悲傷、緊張、憤怒或焦慮等負性情緒。過度或持續(xù)的應(yīng)激會導(dǎo)致機體內(nèi)環(huán)境失衡，免疫功能紊亂而發(fā)生癌癥。（9）其他危險因素 如內(nèi)分泌狀況、免疫狀態(tài)、體重指數(shù)等與肺癌有一定關(guān)系；女性肺腺癌與雌激素水平有關(guān)等。

三、 模型背景

H460細胞系于1982年由A.F. Gazdar自一個男性大細胞肺癌患者的胸腔積液中培養(yǎng)獲得。與普通肺癌細胞相比，該細胞具有較高水平的p53 mRNA的表達并且無總DNA結(jié)構(gòu)異常。免疫酶標(biāo)染色顯示，該細胞具有角蛋白和波形蛋白陽性反應(yīng)，但神經(jīng)絲三聯(lián)體蛋白反應(yīng)陰性。該細胞是人亞三倍體細胞系，典型的染色體數(shù)是57,或者58條染色體數(shù)細胞也存在一定的比例，X和Y染色體在所有細胞中都存在2個拷貝數(shù)。

無胸腺裸鼠（Nude Mouse，簡稱裸鼠）目前已成為醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究領(lǐng)域中不可缺少的實驗動物模型。經(jīng)過世界各國實驗動物遺傳育種學(xué)家的努力，目前已將nu基因?qū)氩煌幌祫游铮蔀橄盗袆游锬Ｐ停瑑H小鼠模型一種，已建立了二十余種近交系裸鼠。由于裸鼠的免疫缺陷，在一定情況下，不排斥來自異種動物的組織移植。因此可作移植人類惡性腫瘤的接受體。根據(jù)T.Fogh等1979～1980年的報導(dǎo)，已有150株人的瘤細胞和人體原發(fā)癌移植于裸鼠獲得成功，目前已成功地結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、腎癌、宮頸癌、軟組織肉瘤和骨肉瘤等移植于裸鼠、獲得了一定百分比（35.7%）的良好生長，并可傳代。若用已建株的人體腫瘤組織培養(yǎng)細胞作移植材料，接種后的成活率更高（41%）。

本實驗中所用鼠種BALB/C-nu/nu，系1973年從丹麥引入日本中央實驗動物所研究。繼續(xù)培育三年后，交由日本CLEA株式會社進行生產(chǎn)。1980年由CLEA引入。雄鼠是無胸腺裸鼠（BALB/C-nu/nu），雌鼠是有胸腺的雜合小鼠（BALB/C-nu/+）。采用BALB/C-nu/+♀與BALB/C-nu/nu♂隨機交配法進行繁殖，已取得較好成果，裸鼠的生產(chǎn)性能良好：受胎率達81.5%，平均產(chǎn)仔率8.1只/窩，平均產(chǎn)裸仔率3.99只/窩，窩平均仔鼠成活3.62只，9周齡仔鼠成活率100%，其主要項目數(shù)據(jù)與日本中央實驗動物研究所（CLEA）和英國實驗動物中心（LAC）發(fā)表的材料基本一致。