1.該模型制備比較成熟，國(guó)內(nèi)外都有此模型，構(gòu)建和評(píng)價(jià)指標(biāo)一致，所以該模型應(yīng)用廣泛，具有統(tǒng)一的操作規(guī)程。

2. 該模型制備的關(guān)鍵：1）小鼠必須是重度免疫缺陷的，而且飼養(yǎng)環(huán)境必須潔凈；2）HIV操作需要生物安全。

3.此模型具有完善的人的免疫系統(tǒng)，HIV感染后，具有艾滋病病人相似的臨床癥狀，所以具有很高的比較醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。

1、 臨床癥狀

感染SHIV-KB9病毒后，A0425在感染后第120天出現(xiàn)食欲不振、水樣腹瀉、掉毛和體重減輕，到感染后第130天發(fā)展至嚴(yán)重水樣腹瀉，至18周后，愈發(fā)虛弱，直至感染后149天瀕臨死亡，動(dòng)物安樂處死，并按計(jì)劃取材留樣。其余感染猴未出現(xiàn)皮疹、體重下降、食欲不振、機(jī)會(huì)性感染等典型的艾滋病癥狀。

2、 SHIV-KB9靜脈感染恒河猴外周血病毒載量結(jié)果

在血漿病毒載量方面，A423和A424在感染后第7天首次出現(xiàn)陽(yáng)性，之后載量上升，A423于感染后第14天達(dá)到它的最高峰（9.62×107 copies/mL），之后緩慢下降，但在我們的觀察期（161天）內(nèi)，一直維持在103 copies水平之上。A424在感染后第10天達(dá)到一個(gè)高峰（5.333×105 copies/mL），之后在103-106之間波動(dòng)，到感染后第56天達(dá)到它的另外一個(gè)高峰（6.082×106 copies/mL），后在我們的觀察期內(nèi)未檢測(cè)到病毒載量。A0425病毒載量在28天為7.22×105copies/mL，35天達(dá)到高峰3.51×108 copies/mL，隨后下降，至10w降到了104 copies/mL，之后出現(xiàn)反彈，達(dá)到4.11×106 copies/mL，并長(zhǎng)期維持在這個(gè)水平上直至發(fā)病。A426動(dòng)物在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，未檢測(cè)到血漿病毒載量陽(yáng)性（圖1）。

圖1 SHIV-KB9靜脈感染中國(guó)恒河猴外周血病毒載量結(jié)果

Fig.1 Theviremia (viral RNA copies/ml plasma) in Chinese-original rhesus macaquesinfected intravenously with SHIV-KB9

1、 SHIV-KB9靜脈感染恒河猴CD4+/CD8+比值結(jié)果

四只實(shí)驗(yàn)猴CD4+/CD8+比例結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)前，其比值均大于1。接種病毒后，A423-A425在感染后前5周有個(gè)下降－回升－再下降的過(guò)程，其中A423于感染后21天降至最低值0.15，之后緩慢回升，在161天之前都在0.5之下徘徊，之后進(jìn)入波動(dòng)期，在0.26-0.78之間波動(dòng)，但總體趨勢(shì)是上升的，并于感染后357天回升至1.08。A424在前五周有幾個(gè)幅度較大的波動(dòng)，并于感染后35天達(dá)到最低點(diǎn)0.48，之后緩慢回升，從第35天的0.48一直波動(dòng)回升到第329天的1.67。A425的初始CD4+/CD8+比值是四只猴中最高的，它在感染后第35天CD4+/CD8+比值達(dá)到最低點(diǎn)0.0125，之后緩慢回升，但一直維持在0.2以下，直至安樂處死。 A426的CD4+/CD8+比值在前三個(gè)月一直未見異常變化，到感染后91天出現(xiàn)下降，之后回升，維持于1附近（圖2）。

圖2 SHIV-KB9靜脈感染中國(guó)恒河猴外周血CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值

Fig.2 The changes of CD4+/CD8+ ratio ofT lymphocytes in Chinese-originalrhesus macaques infected intravenously with SHIV-KB9

SHIV-KB9靜脈感染恒河猴CD4+細(xì)胞絕對(duì)數(shù)結(jié)果

病毒感染前，A4023-A0426四只猴的CD4+ T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)都在1000個(gè)/μL以上。SHIV-KB9感染后，四只猴在感染后前三周都有個(gè)上升－下降－再上升－再下降的過(guò)程，（圖3）。A0423在感染后21天到達(dá)最低點(diǎn)每μL血液中244個(gè)CD4+細(xì)胞，之后緩慢上升，到感染后203天超過(guò)1000個(gè)/μL。A0424在感染后28天到達(dá)最低點(diǎn)每μL血液中418個(gè)CD4+細(xì)胞，之后波動(dòng)上升，到感染7周之后超過(guò)1000個(gè)/μL。A0425對(duì)SHIV-KB9的反應(yīng)最強(qiáng)烈，在感染后3天它的CD4+ T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)從最初的1073個(gè)/μL，迅速升到4270個(gè)/μL，到第10天更是升至5254個(gè)/μL，之后迅速下降，到感染后35天降為16個(gè)/μL，并維持這個(gè)水平一直到安樂。A0426也是在感染后28天到達(dá)最低點(diǎn)每μL血液中465個(gè)CD4+細(xì)胞，之后波動(dòng)上升，到感染11周之后超過(guò)1000個(gè)/μL。

圖3 SHIV-KB9靜脈感染中國(guó)恒河猴外周血CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)

Fig.3 The CD4+ T cell counts(per l blood) in Chinese-original rhesus macaques infected intravenously with SHIV-KB9

1、 實(shí)驗(yàn)用病毒：感染毒株為SHIV-KB9中國(guó)恒河猴細(xì)胞適應(yīng)株，RT-PCR測(cè)定病毒拷貝數(shù)為4.8×108copies/mL。

2、 感染動(dòng)物：選用體重4-6kg的SPF恒河猴。實(shí)驗(yàn)前體檢無(wú)異常，必須排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒(SRV-1，2，5)和猴T淋巴細(xì)胞性I型病毒(STLV-1)的感染。猴免疫缺陷病毒（SIV）易感性密切相關(guān)的4種基因（Mamu-A*01、Mamu-A*02、Mamu-B*08、Mamu-B*17）篩查結(jié)果為陰性。所有感染動(dòng)物必須在ABSL-3室中進(jìn)行。

3、 感染方法：4只恒河猴編號(hào)分別為A0423、A0424、A0425和A0426。病毒原液依次用無(wú)血清1640培養(yǎng)液做10倍系列稀釋。經(jīng)后肢靜脈感染，每只猴注射1mL稀釋好的病毒液。A0423-A0426分別注射10-1-10-4病毒液1mL。持續(xù)測(cè)定8個(gè)月。

4、 SHIV-KB9靜脈感染猴樣品采集和指標(biāo)測(cè)定：在感染前和感染后3、7、10、14、17、21、28、35、42、49、56、70及84天采集猴靜脈血6mL，3mL EDTA抗凝，用于病毒載量和CD4+/CD8+值測(cè)定。

5、 SHIV-KB9靜脈感染猴血漿病毒載量的測(cè)定：提取EDTA抗凝血漿中病毒RNA，使用SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法測(cè)定血漿病毒載量。

6、 SHIV-KB9靜脈感染猴外周血CD4+/CD8+比值及絕對(duì)數(shù)測(cè)定：CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE抗體標(biāo)記EDTA抗凝全血淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測(cè)定CD4+/CD8+比值，并根據(jù)血常規(guī)結(jié)果，計(jì)算出CD4+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。

一、 艾滋病概述

艾滋病(AcquiredImmunodeficiency Syndrome, AIDS)，是由人免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiency Virus, HIV）引起，以全身免疫系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p害為特征的傳染性疾病，是20世紀(jì)危害人類健康和生命最嚴(yán)重的病毒性疾病之一。自美國(guó)CDC報(bào)道首例艾滋病后，到20世紀(jì)80年代中期艾滋病發(fā)展成為一個(gè)性的流行病。截止2014年底，HIV已感染3690萬(wàn)人，2014年新增感染者200萬(wàn)，2014年因艾滋病死亡120萬(wàn)人。艾滋病在1985年傳入我國(guó)，截至2015年5月31日，歷年累計(jì)報(bào)告艾滋病530628例，其中艾滋病病人217457例，死亡167159例。艾滋病早已成為關(guān)注的公共衛(wèi)生和社會(huì)熱點(diǎn)問(wèn)題，艾滋病的預(yù)防與治療也成為當(dāng)代生物醫(yī)學(xué)研究的前沿?zé)狳c(diǎn)之一。

二、艾滋病動(dòng)物模型簡(jiǎn)介

艾滋病發(fā)病機(jī)制研究、藥物和疫苗的保護(hù)性研究及評(píng)價(jià)等方面在很大程度上依賴?yán)硐氲膭?dòng)物模型。SIV/SAIDS(猴艾滋病)模型被廣泛接受和應(yīng)用，表現(xiàn)為和AIDS的臨床表征，發(fā)病過(guò)程、免疫缺陷特征等非常相似。然而，由于HIV與SIV畢竟是兩種不同的病毒，它們?cè)诨蛐蛄小そY(jié)構(gòu)和抗原性之間存在一定差異，使該模型的使用有一定的局限性。近年來(lái)，人們應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，將HIV-1重要基因與SIV做成嵌合體病毒（SIV/HIV-1，簡(jiǎn)稱為SHIV）感染恒河猴，用以研究HIV不同基因的功能以及病毒與宿主的相互作用。

Reimann等人以SIVmac239病毒基因組和B亞型HIV-1病毒的env基因?yàn)橹黧w構(gòu)建的一株嵌合病毒，即SHIV-89.6，經(jīng)動(dòng)物體內(nèi)傳代及克隆得到SHIV-KB9。由于在中國(guó)流行的8種類型毒株中，B'亞型是我國(guó)目前主要流行的HIV-1亞型，占47.5%。我國(guó)HIV-1B'亞型毒株與B.TH.92.92TH014最為接近，中國(guó)HIV-1B'亞型標(biāo)準(zhǔn)株的核苷酸序列與國(guó)際常用HMA分型的TH14、IND868、MA959、TH22等序列比較，相應(yīng)亞型的核苷酸同源性是：B亞型90.2%,88.3%，說(shuō)明B亞型和B'亞型之間存在很高的親緣性。因此，SHIV-KB9病毒建立的動(dòng)物模型，對(duì)我國(guó)的艾滋病疫苗以及疫苗評(píng)價(jià)和應(yīng)用意義重大，為我國(guó)的疫苗研制提供很好的研究和評(píng)價(jià)平臺(tái)。

艾滋病的三種傳播途徑分別是經(jīng)血液、性和母嬰傳播，性傳播包括同性傳播和異性傳播兩種方式。艾滋病動(dòng)物模型的制備首先要考慮其實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，最好的動(dòng)物模型可以最大限度的模擬人類疾病，包括使用與自然感染相同或接近的方式建立模型。為充分模擬靜脈注射吸毒人群的感染方式，通過(guò)靜脈途徑，病毒直接感染血液中的靶細(xì)胞，從而制備靜脈途徑艾滋病恒河猴感染模型。