給予動(dòng)物鼠籠傾斜、潮濕墊料、高溫、噪音、束縛、電擊、游泳、晝夜節(jié)律顛倒等不同刺激因子，且刺激因子安排為多變性和不可預(yù)測，可誘導(dǎo)性是模型制造成功的關(guān)鍵。該模型被廣泛用于抑郁癥神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制及抗抑郁藥物的研究，以及伴發(fā)的焦慮、學(xué)習(xí)記憶障礙及防護(hù)藥物研究。

本研究中，通過水迷宮實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看CUMS模型組水迷宮尋臺(tái)潛伏期顯著性延長，避暗錯(cuò)誤次數(shù)顯著性增加、避暗潛伏期顯著性減少等，這些行為學(xué)結(jié)果，提示大小鼠CUMS模型成功。此外本實(shí)驗(yàn)還對CUMS模型的機(jī)制進(jìn)行了基礎(chǔ)研究，認(rèn)為CUMS模型會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物皮層的5-HT、DA、Ach、NE等神經(jīng)遞質(zhì)水平顯著性降低（P<0.05）。因此我們認(rèn)為采用慢性不可預(yù)測應(yīng)激，35天可以造成大鼠和小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。

模型技術(shù)難點(diǎn)在于對于CUMS刺激因子的選擇，刺激因子的選擇可能影響實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷某晒εc否，常用的刺激因子有禁食(12 h)、禁水(12 h)、冷水游泳(4 °C，5 min)、熱水游泳(42 °C，5 min)、動(dòng)物叫聲(0.5 h)、束縛(使用自行研發(fā)的小鼠行為限制器，長20 cm，直徑7 cm)、晝夜顛倒、配對飼養(yǎng)、濕籠、傾籠等。每日選擇2~3 種刺激，并盡量使應(yīng)激程序符合不可預(yù)測的特點(diǎn)，以避免動(dòng)物產(chǎn)生適應(yīng)性。相同的刺激因子應(yīng)該隔3-7日再進(jìn)行。

本研究通過不同的刺激因子對老鼠造成慢性不可預(yù)測應(yīng)激模型，通過水迷宮、避暗等經(jīng)典行為學(xué)指標(biāo)，以及5-HT、DA、Ach、NE等神經(jīng)遞質(zhì)基礎(chǔ)機(jī)制指標(biāo)，表明了慢性不可預(yù)測應(yīng)激誘導(dǎo)老鼠學(xué)習(xí)記憶損傷模型的成功，并且該模型對于大小鼠具有相同的效果，本模型可用于進(jìn)一步的改善學(xué)習(xí)記憶藥物的藥效學(xué)評價(jià)。

本實(shí)驗(yàn)采用健康成年SPF級老鼠。飼料墊料均為高壓滅菌產(chǎn)品，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物用水均經(jīng)過除菌處理。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以完整的包裝直接進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，觀察適應(yīng)5天后無異常情況，方進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)規(guī)范，對環(huán)境和生態(tài)影響等符合國家相關(guān)法律規(guī)定。

1、基因型鑒定

利用PrP-hAPPK595N/M596L轉(zhuǎn)基因小鼠和PrP-hPS1δE9轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行雜交，所得新生小鼠1 周內(nèi)剪鼠尾進(jìn)行PCR 鑒定APP/PSN轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基因表型鑒定, 保留陽性小鼠。轉(zhuǎn)基因小鼠在出生9 ～ 14 d 用剪趾法標(biāo)記, 收集剪下的組織及鼠尾, 用堿裂解法提取基因組DNA , PCR 分別檢測APPK595N/M596L 及hPS1δE9基因的表達(dá)。APP基因PCR 產(chǎn)物長344 Kb , PSN基因PCR 產(chǎn)物長608 Kb。

PCR 鑒定APP 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的凝膠電泳分析

2、APP/PSN雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠的病理表現(xiàn)

5月齡出現(xiàn)老年斑，12月齡有大量老年斑形成。

3、APP/PSN雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠的行為表現(xiàn)（水迷宮實(shí)驗(yàn)）

經(jīng)過檢驗(yàn)前5 d 學(xué)習(xí)有效, 所有小鼠都能較快的找到平臺(tái)。隨后第6天撤出平臺(tái), 進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。Ethovision XT 監(jiān)測分析軟件記錄小鼠在目標(biāo)區(qū)域(即第4 、5 區(qū))的穿梭次數(shù)和停留時(shí)間。Morris水迷宮試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3 、6 、9 月齡APP/PSN雙轉(zhuǎn)基因小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果與同月齡野生型小鼠相比有顯著差異, 較同月齡野生型C57BL/6J小鼠學(xué)習(xí)及記憶能力降低。

Morris 水迷宮第六天空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

利用PrP-hAPPK595N/M596L和PrP-hPS1δE9雙轉(zhuǎn)基因培育而成。背景品系是C57BL/6J，啟動(dòng)子為Mouse prion protein（PrP）, 靶基因信息：Human presenilin 1 and APP。

一、 AD簡介

臨床癥狀主要表現(xiàn)為記憶、認(rèn)知、理解、判斷推理能力以及社會(huì)適應(yīng)能力、個(gè)人生活能力慢性進(jìn)行性減退，最終發(fā)展為嚴(yán)重癡呆。

病理表現(xiàn)主要為大腦內(nèi)出現(xiàn)老年斑，神經(jīng)原纖維纏結(jié)，神經(jīng)元丟失等。

發(fā)病機(jī)制主要包括tau蛋白過度磷酸化，淀粉樣蛋白沉積，載脂蛋白E的多態(tài)性，淀粉樣前體蛋白變異及其轉(zhuǎn)化過程發(fā)生改變，氧化應(yīng)激和代謝損害等。

二、 APP，PS1與AD

APP基因位于染色體21q21.3，由20個(gè)外顯子和若干內(nèi)含子組成，由于基因轉(zhuǎn)錄后剪接方式的不同，所得的mRNA可翻譯生成數(shù)種亞型，其中最主要的為APP695，APP751，APP770。APP作為一種管家基因，在多種組織中均有表達(dá)，但不同組織表達(dá)的APP亞型有所不同，其中APP695在腦組織中表達(dá)量最多，APP基因突變引起的AD病例只占總病例的一小部分，但是具有代表性。PS1基因位于14q24.3，到目前為止發(fā)現(xiàn)90多個(gè)突變點(diǎn)，與早老性AD的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

APP蛋白是一種I型擴(kuò)莫蛋白，在哺乳動(dòng)物中有兩個(gè)同源蛋白APLP1，APLP2。APP翻譯后經(jīng)過N-和O-糖基化，磷酸化以及絡(luò)氨酸硫酸化等修飾。經(jīng)過兩種途徑進(jìn)行水解，即不產(chǎn)生Aβ的途徑和產(chǎn)生Aβ的途徑。正常大腦中，APP主要經(jīng)過α分泌酶進(jìn)行水解，其在Aβ區(qū)段由α分泌酶水解，從而阻止Aβ的形成。一旦APP水解異常，將會(huì)導(dǎo)致大腦內(nèi)Aβ的聚集，形成老年斑。PSI蛋白是一個(gè)內(nèi)含有467個(gè)氨基酸的多次跨膜蛋白，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高爾基體及細(xì)胞表面。PSI作為γ分泌酶的催化亞基，其表達(dá)異常導(dǎo)致APP水解異常，從而參與了大腦內(nèi)老年斑的形成。